人ELISA試劑盒通過優化試劑、信號放大和檢測技術，實現蛋白或抗體的超靈敏定量（通常達pg/mL至ng/mL級別）。
1. 高親和力抗體對
捕獲抗體與檢測抗體的優化：
選擇針對目標蛋白不同表位的高特異性單克隆抗體（如重組單抗或親和層析純化的抗體），減少非特異性結合。
通過抗體配對篩選（如棋盤滴定法），確保捕獲抗體與檢測抗體的組合信號輸出。
抗體濃度與包被條件：
優化捕獲抗體的包被濃度和時間，確?？乖Y合位點充足。
使用高吸附能力的載體，提升抗原捕獲效率。
2. 酶催化信號放大
辣根過氧化物酶（HRP）底物系統：
采用高靈敏度底物（如TMB、ABTS），HRP催化反應產生有色產物（如TMB氧化后顯藍色），可檢測低至10^-18 mol的酶活性。
通過延長顯色時間（如30分鐘）或提高反應溫度（如37℃），增強信號強度。
化學發光（ECL）或電化學發光（ECL）：
使用魯米諾類底物，在HRP催化下發出光子，通過化學發光儀檢測，靈敏度可達10^-20~10^-24 mol。
電化學發光（如聯吡啶釕標記）通過電極激發，背景噪音更低，適合超微量檢測。
3. 信號擴增技術
生物*-鏈霉親和素系統（BA系統）：
檢測抗體標記生物*，通過鏈霉親和素-HRP復合物間接結合，實現信號級聯放大（如每一步結合可放大2~10倍信號）。
納米材料應用：
使用磁性納米顆粒（如Fe3O4）作為固相載體，增加抗原吸附面積。
金納米顆粒或量子點標記抗體，通過多信號輸出（如熒光+比色）提升靈敏度。
4. 樣本處理與濃縮
血清/血漿預處理：
通過離心、過濾或免疫沉淀（IP）去除高豐度蛋白，降低基質干擾。
使用蛋白A/G磁珠去除樣本中的非目標抗體，避免競爭性抑制。
超濾濃縮：
對低濃度樣本（如細胞培養上清）進行超濾離心，濃縮目標蛋白10~100倍。
二、人ELISA試劑盒通實驗操作優化：
1. 標準曲線設計
梯度稀釋：設置至少6個濃度梯度，涵蓋預期樣本濃度范圍。
低濃度擴展：在極低濃度區增加多點，擬合非線性曲線。
2. 孵育條件優化
延長抗原-抗體反應時間：捕獲抗體與抗原的孵育時間從1小時延長至2~3小時，確保低濃度抗原充分結合。
封閉液選擇：使用含BSA、酪蛋白或Tween-20的封閉液，封閉板內非特異性結合位點，降低背景噪音。
3. 信號讀取與數據分析
酶標儀參數設置：
比色法：選擇雙波長檢測。
化學發光：積分時間設為1~10秒，避免信號飽和。
數據擬合：
使用四參數邏輯擬合（4PL）替代線性回歸，準確計算低濃度樣本值。
設置閾值，排除背景干擾。
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